Корзина
10 отзывов
E-MAIL: marketing@theseuslab.cz
+375 17 2374211

Анализ каннабиноидов

Анализ каннабиноидов
Анализ каннабиноидов с применением метода жидкостной хроматографии/тандемной масс-спектрометрии (ЖХ/МС/МС)

20.07.17

Статья 1.

Количественный анализ натуральных каннабиноидов с применением метода жидкостной хроматографии/тандемной масс-спектрометрии (ЖХ/МС/МС)

Jonathan Edwardsen, Shimadzu Scientific Instruments

Количественный анализ природных каннабиноидов проводился с использованием масс-спектрометра LCMS-8050 с тройным квадрупольным детектором. В зависимости от конкретного каннабиноида был достигнут нижний предел количественного определения (LLOQ) 1-4 нг/мл. Данный метод показал, что некоторые лекарственные масла или настойки, доступные в сети интернет, содержали каннабиноиды, встречающиеся в природе.

Анализ естественных каннабиноидов необходим не только из-за потенциального медицинского использования этих соединений, но также и для регулирования и контроля качества продуктов, содержащих эти соединения. Для обеспечения подлинности, качества и количества каждого каннабиноида, содержащегося в продукте, был разработан метод ЖХ/МС/МС в котором применяется тройной квадрупольный масс-спектрометр Shimadzu LCMS-8050.


Условия проведения эксперимента

После разбавления в стандартном чистом метаноле естественных каннабиноидов для оптимизации источника, условий диссоциации, индуцированной столкновениями (CID) и ионной селекции продукта применялся анализ с вводом пробы в поток. Оптимальные условия ЖХ были получены эмпирически, 3-минутный градиентный метод был разработан с использованием колонки Restek. С применением стандартных растворителей были созданы калибровочные кривые, после чего проанализированы различные медицинские настойки.

Оптимизация каннабиноида идентифицировала один квантификатор и два иона-определителя для каждого встречающегося в природе каннабиноида. На основе интенсивности ионов и повторяемости по нескольким энергиям столкновения были выбраны два иона. Для всех каннабиноидных соединений выбранными родительскими ионами были [M+H]+. После MRM оптимизации и формировании хроматографических условий для каждого каннабиноида с n = 6 была построена стандартная кривая.


Результаты и обсуждение

Рисунок 1 – а) Хроматограмма семи каннабиноидов при 100 нг/мл в растворителе; б) Хроматограмма коммерчески доступной настойки, содержащей семь каннабиноидов.

Для каждого каннабиноида были установлены нижние пределы количественного обнаружения 1 нг/мл, за исключением CBC, для которого предел составлял 4 нг/мл. Было определено, что минимальное отношение сигнал/шум для всех каннабиноидов больше или равно 20: 1. Применялось взвешивание калибровочной кривой: 1/концентрация (1/C), либо 1/концентрация2 (1/C2). Хроматографический метод, который был разработан, дал базовое разделение шести из семи каннабиноидов с совместно элюируемым CBG (m / z 317,25) и CBD (m / z 314,95). Несмотря на то, что эти пики совместно элюировались, LCMS-8050 смог идентифицировать и количественно определить их без полного разделения базовой линии. Все семь каннабиноидов обнаружены в коммерчески доступной настойке, приобретенной онлайн (рисунок 1). Концентрации для каждого каннабиноида представлены в таблице 1. Не наблюдалось никакого эффекта памяти от предыдущих проб в подвижной фазе, введенной сразу после стандарта наивысшего уровня.


Заключение

Эта работа демонстрирует быстрый метод обнаружения естественно встречающихся каннабиноидов с использованием Shimadzu LCMS-8050. Все семь каннабиноидов были обнаружены при уровне, равном 1 нг/мл (1 пг на колонке) с отношением сигнал/шум по меньшей мере 20:1. Этот метод полезен для количественного определения каннабиноидов в сырьевых или коммерческих продуктах.

Таблица 1 - Количественные результаты для каждого каннабиноида на пределе количественного определения и концентрации коммерческой настойки. Количественные результаты при LLOQ (n = 6)

Соединение

Предел обнаружения (нг/мл)

СКО, %

Точность, %

Отношение сигнал/шум

Взвешивание

Коммерческая настойка

|CBN

1

4.516099

99.998± 4.2%

58.96

1/C2

0.016 % ± 0.001 %

THCA

1

7.023558

99.998 ± 9.1%

21.14

1/C

0.452 % ± 0.018 %

CBDA

1

6.671582

100.001 ± 5.7%

70.42

1/C2

0.019 % ± 0.001 %

Δ9 THC

1

6.414479

99.997 ± 6.3%

85.89

1/C2

0.370 % ± 0.021 %

CBG

1

3.666911

100.000 ± 3.7%

2397.6

1/C2

0.018 % ± 0.0004 %

CBD

1

7.770838

100.123 ± 6.8%

107.4

1/C2

0.006 % ± 0.001 %

CBC

2.5

8.193242

100.006+ 5.7%

70.64

1/C

0.029 % ± 0.006 %

 

 

Статья 2.

Быстрое определение 24 синтетических и натуральных каннабиноидов с применением метода жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии (ЖХ-МС-МС) в натуральных продуктах и задачах по проверке лекарств

Марихуана, общий или сленговый термин для конопли в травяной форме, является одним из наиболее широко используемых незаконных наркотиков в мире. Синтетические каннабиноиды оказывают сходное с естественными психотропное воздействие и быстро распространяются на «чёрном» рынке. Чтобы справиться с такой распространенностью и разнообразием, была разработана целевая и нецелевая методика скрининга методом жидкостной хроматографии – тандемной масс-спектрометрии (ЖХ-МС-МС), позволяющая проводить одновременный анализ 24 синтетических и природных каннабиноидов за 8 мин для широкого спектра образцов, таких как травяные курительные смеси, ароматические палочки, сыворотки и растительный материал каннабиса. Особое преимущество метода ЖХ-МС-МС состоит в том, что полное сканирование при МС-захвате предоставляет точные массы для всех обнаруженных веществ и, таким образом, позволяет проводить постаналитическую идентификацию первоначально нецелевых соединений.

Первичным психоактивным соединением каннабиса является Δ9-тетрагидроканнабинол (THC), который проявляет свою активность, взаимодействуя с каннабиноидными рецепторами CB1 и CB2 в головном мозге. Синтетические аналоги THC во время курения или глотания могут имитировать психотропные эффекты каннабиса, связывая одни и те же рецепторы (1). Каннабимиметические соединения можно найти в травяных смесях (ароматических палочках, сигаретах, спайсах, К2), сыворотках и других растворах, часто без указания их наличия. Европейский центр мониторинга наркотиков и наркомании сообщил в 2009 году (2), что спайсы (3) обычно используются подростками и молодыми людьми, поскольку они позволяют им проходить тесты на выявление наркотиков. Многие правительства приняли законодательные меры для контроля над конкретными синтетическими каннабиноидами. В Соединенных Штатах они были перечислены в Списке I препаратов по Закону о контролируемых веществах, а в Канаде - как препараты Списка II. Однако небольшие структурные модификации контролируемого вещества приводят к тому, что новые аналоги являются законными. Поэтому в мае 2012 года Соединенные Штаты внесли поправки в Закон и предложили законопроект о размещении всех каннабимиметических агентов в качестве препаратов Списка I (4,5).

Учитывая структурное сходство между THC и его синтетическими аналогами, идентификация соединений в изъятых образцах является постоянной проблемой для государственных учреждений. Как только аналоги добавляются в списки контролируемых веществ, синтезируются новые, что делает их целью для мониторинга (6-9).

Очевидно, что новые вещества отсутствуют в библиотеках масс-спектроскопии или УФ-спектров; Поэтому обычные методы скрининга каннабиниматиков в продуктах и биожидкостях быстро становятся малоэффективными.

Наиболее распространенные методы анализа каннабиноидов используют газовую хроматографию (ГХ)-МС (10,11) и жидкостную хроматографию (ЖХ)-МС (9,12-14).

Для идентификации веществ подходы ГХ-МС используют спектры МС известных каннабиноидов, большинство подходов ЖХ-МС используются в режиме мониторинга множественных реакций (MRM). Оба метода являются целевыми, они ограничены скринингом известных видов и, следовательно, всегда находятся на шаг позади по отношению к рынку с постоянно обновляемыми формулами наркотиков. 

Таблица 1 – Спектры со связанными структурами, найденные в программном обеспечении NIST

Наименование стандарта

(Молекулярная формула)

[M+H]+

(m/z)

MS2

(m/z)

MS3

(m/z)

AKB48 N-(5- фторпентил) аналог

(C23H30FN3O)

384.245

134.97

Не применяетя

AM-694

(C20H19FINO)

436.057

230.93, 309.25, 234.11

202.99, 93.96

AM-694 3-иод-изомер (C20H19FINO)

436.057

230.95, 202.96

202.96, 220.89, 94.06

AM-1220

(C26H26N2O)

383.212

286.20, 154.99, 112.00

154.96, 157.97, 127.00

AM-2201

(C24H22FNO)

360.176

155.00, 232.12, 126.92

144.05, 212.11, 176.16

AM-2201 2'-нафтил-изомер (C24H22FNO)

360.176

154.98, 232.18, 126.87

143.93, 176.28

AM-2201 W-(4-фторпентил) изомер (C24H22FNO)

360.176

155.01, 232.15, 340.27

212.12, 144.05, 176.01

CP 47,497 - H2O

(C21H32O)

301.253

175.07, 261.23

233.21

(±)-CP 47,497-C8-гомолог – H2O

(C22H34O)

315.268

175.11, 241.23

Не применяетя

(±)-epi CP 47,497-C8-гомолог – H2O

(C21H32O)

301.253

175.06, 261.22

Не применяетя

(±) -3-epi CP 47,497-C8- гомолог – H2O (C22H34O)

315.268

175.11, 241.23

Не применяетя

JWH-018

(C24H23NO)

342.185

154.89, 214.08, 126.92

143.89, 157.98

JWH-019

(C25H25NO)

356.201

154.91, 228.10, 126.94

143.92, 157.93,129.96

JWH-073

(C23H21NO)

328.17

154.92, 200.05, 126.91

143.92, 158.04

JWH-081

(C25H25NO2)

372.196

185.06, 214.12, 157.06

144.04, 158.06, 200.07

JWH-122

(C25H25NO)

356.201

168.98, 214.07, 140.95

143.88, 158.00

JWH-200

(C25H24N2O2)

385.191

155.05, 298.12, 127.05

268.11, 283.10, 200.08

JWH-210

(C26H27NO)

370.217

182.99, 214.09, 155.00

143.93, 158.01, 116.01

JWH-250

(C22H25NO2)

336.196

120.91, 188.06, 131.87

131.99, 117.91

STS-135

(C24H31FN2O)

383.249

232.12, 135.02, 206.12

143.94, 212.13, 158.07

Каннабидиол (CBD)

(C21H30O2)

315.232

259.21, 193.06, 233.15

231.12, 217.06, 189.06

Каннабигерол (CBG)

(C21H32O2)

317.248

193.10, 207.09, 261.24

122.90, 136.89

Каннабинол (CBN) (C21H26O2)

311.201

293.19, 223.10, 241.12

195.03, 208.02, 205.04

A9- Тетрагидроканнабинол (Δ-9-THC)

(C21H30O2)

315.232

259.18, 193.07, 233.13

231.08, 217.16, 189.00


Чтобы устранить этот недостаток, был разработан целевой-нецелевой подход МС высокого разрешения для скрининга различных образцов каннабиноидоподобных соединений. Метод включает в себя нецелевое сканирование с высоким разрешением, которое позволяет идентифицировать все вещества, присутствующие в образце, и нацелен на выбор 20 синтетических и природных четырех каннабиноидов (рисунок 1). 


Эксперимент

Реактивы и стандарты

Метанол и ацетонитрил ЖХ-МС-класса были получены от J.T. Baker (TekniScience) и муравьиная кислота ЖХ-МС (98%) была получена от Fluka (Sigma-Aldrich). Для приготовления всех водных растворов и подвижных фаз для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) использовали высококачественную воду из системы Milli-Q Reference A + (Fisher Scientific). Всего было исследовано 24 стандарта. WH-018 и JWH-210 были получены от Toronto Research Chemicals Inc. AKB48 N-(5-фторпентил) аналог, AM-694, AM-694 3-иод изомер, AM-1220, AM-2201, AM-2201 2'-нафтиловый изомер, AM-2201 N-(4-фторпентил) изомер, CP 47,497, (±)-CP 47,497-C8-гомолог, (±)-эпи CP 47,497-C8-гомолог, (±) 3-эпикарбамент CP 47,497-C8-гомолог, JWH-019, JWH-073, JWH-081, JWH-122, JWH-200, JWH-250 и STS-135 были получены от Cayman Chemical. Δ9-тетрагидроканнабинол и каннабинол были приобретены у компании Alltech/Grace. Каннабидиол был приобретен у Lipomed, а каннабигерол был приобретен у THC PHARM. 

Маточные растворы индивидуальных стандартов готовили отдельно в мерных колбах емкостью 10 мл при приблизительной концентрации в метаноле 100 мкг/мл. Разбавленные исходные растворы (от 100 нг/мл до 1 мкг/мл) непосредственно вводили в масс-спектрометр для корректировки экспериментальных параметров для каждого аналита. Для регулирования хроматографического разделения всех аналогов также готовили и инъецировали стандартную смесь из 24 компонентов.

 

Подготовка образцов

Для определения эффективности и устойчивости метода ЖХ-МС-МС были проанализированы 10 изъятых образцов и образец каннабиса. Образцы были представлены в двух формах: таблетки и растительные продукты (ароматическая палочка, сигарета и растение конопли). Образцы были тонко измельчены, затем 5-10 мг аликвоты полученного порошка переносили в мерные колбы 10 мл и растворяли в метаноле-воде-ацетонитриле 70:20:10, содержащем 1% муравьиной кислоты. После этого растворы встряхивали в течение 2 мин, в течение 10 мин обрабатывали ультразвуком и снова форстрировали на протяжении 3 мин. Супернатант фильтровали через пористый 0,45 мкм политетрафторэтиленовый (ПТФЭ) шприцевый фильтр (Phenomenex). В отношении травяных образцов проводилось дополнительное центрифугирование в течение 10 мин при скорости 3500 об/мин, чтобы избежать массовой перегрузки шприца. Перед вводом фильтраты разбавляли в 10-100 раз в воде-ацетонитриле 80:20, исходной подвижной фазе. 

Рисунок 1 – Исследованные химические структуры и точные массы 24 синтетических и природных каннабиноидов

 

Рабочие условия ЖХ-МС-МС

Данные были получены с помощью масс-спектрометра LTQ Orbitrap XL, соединенного с системой Acela HPLC (Thermo Scientific). Для управления системой и обработки данных использовались программы Xcalibur 2.1 и Thermo LTQ Tune Plus 2.5.5 (Thermo Scientific). Во всем проекте использовалась внешняя калибровка массы. Первоначально были протестированы четыре аналитические колонки для определения их хроматографических характеристик: колонки XTerra C18 100 мм х 2,1 мм, 3,5 мкм dp и Acquity ВЕН C18 100 мм х 2,1 мм, 1,7 мкм dp, обе от Waters; колонка Kinetex С18 с размером 75 мм х 2,1 мм, 2,6 мкм dp от Phenomenex; и колонка Accucore aQ С18 с размерами 100 мм х 2,1 мм, 2,6 мкм dp от Thermo Scientific. Во время разработки методики также были протестированы две системы элюентов, вода-метанол и вода-ацетонитрил, содержащие 0,1% муравьиной кислоты в условиях общего градиента (5-95% органического вещества).

Оптимизированные разделения проводили, используя колонку Accucore aQ, соединенную с предколонкой Phenomenex C18 с размером 4 мм х 2,0 мм, обе колонки поддерживали при температуре 40°C и водно-ацетонитриловом градиенте. Чтобы избежать деградации образца температура автоматического пробоотборника была установлена на уровне 10°C. Элюенты состояли из 0,1% муравьиной кислоты, добавленной в воду (элюент А) и 0,1% муравьиной кислоты, добавленной в ацетонитрил (элюент В), исходная подвижная фаза содержала 20% В. При скорости потока 350 мкл/мин применяли следующее градиентное элюирование: 20-58% В в течение 1 мин, удержание 58% В в течение 1 минуты, увеличение до 85% В в течение 1 минуты, затем удержание 85% В в течение 2 минут. После чего элюент возвращали до 20% В в течение 12 секунд. Система была повторно калибрована в течение 2,8 минут, общее время цикла составило 8,0 мин. Объем впрыскивания составлял 3-5 мкл. В методику была включена стадия промывания иглой с использованием смеси метанол-вода-ацетонитрил 70:20:10. Заготовку 5 мкл, состоящую из начальной подвижной фазы, вводили после каждого образца для контроля и снижения любого потенциального переноса. Интерфейс электрораспыления работал в режиме положительных ионов. В качестве защитного  вспомогательного газа применялся азот, в то время как гелий применялся в качестве газа для соударений.

Для каждого из аналитов параметры оборудования настраивались полуавтоматически с применением прямой инфузии посредством инструментов программного обеспечения LTQ Tune Plus. Родительские ионы всех аналитов показали сходное поведение из-за их сходных структур. После отдельного скрининга каждого соединения экспериментальные были установлены значения параметров полного сканирования, которые были признаны подходящими для всех аналитов: расход защитного и вспомогательного газа 44 и 17 единиц (приборные единицы), соответственно; напряжение спрея – +3500 В; температура капилляра – 310 °C; напряжение капилляра – 28 В; трубчатый объектив – 101. Для каждого соединения переходы MS2 и MS3 определялись с помощью инструмента настройки и изменения нормированной энергии столкновения. 

После оптимизации они находились в диапазоне от 25 % до 33 %. Поэтому для выполнения усредненной фрагментации на каждом соединении использовалась энергетическая функция трехступечатого столкновения, при 25%, 30% и 35%. Ионные переходы MS2 и MS3 для каждого стандарта показаны в таблице 1, где переходы MS3 возникают из значения MS2, выделенного жирным шрифтом. Масс-спектры получали из m/z (удельного заряда) в диапазоне от 50 до 1000 с помощью двух сканирований: первое полное сканирование с преобразованием Фурье (FT)-МС для точного определения массы, второй шаг МС-МС выполнялся только для прекурсоров из родительского массового списка с динамическим исключением 10 с. После чего каждый стандарт вводили в колонку индивидуально для определения времени выхода пика и подтверждали точную массу родительского иона, MS2 и MS3. Для определения наличия каких-либо взаимодействий между соединениями вводили смесь из 24 стандартов.


Результаты и обсуждение

Разработка и валидация методики

Как видно из рисунка 1, многие из 24 соединений имеют схожие структуры, что делает сложным хроматографическое разделение. Между протестированными подвижными фазами наилучшую селективность дает ацетонитрильный градиент. 

Среди тестируемых колонок наилучшую селективность и удержание ранних элюированных аналитов обеспечивала Accucore aQ.

Селективность была дополнительно улучшена путем сочетания оптимизированного хроматографического метода с масс-спектрометром с орбитальной ионной ловушкой высокого разрешения. Для обеспечения соответствующей чувствительности в отношении всех 24 компонентов в одном анализе посредством индивидуального прямого введения стандартов были выбраны конечные оптимизированные параметры обнаружения при полном сканировании (значения, представленные в разделе условий работы ЖХ-МС-МС). Точность определения массы по всему исследованию находилась в пределах 3 ppm.

При работе системы МС с орбитальной ионной ловушкой и разрешением 30000 было получено приблизительно 1,5 сканирования (точек) в секунду для смеси, содержащей 24 одновременно анализируемых стандарта. Такая скорость сканирования хорошо подходит для узких пиков (5-8 с в ширину), полученных с помощью хроматографии частиц со структурой ядро-оболочка, что позволило получить очень надежную количественную оценку и улучшить чувствительность метода. Хорошо подобранные переходы родительских фрагментов помогли повысить селективность метода. Как показано на рисунке 2 (распределение по 3 графикам для облегчения идентификации пика), было возможно позитивно идентифицировать 24 каннабиноида, дифференцируя их с помощью комбинации точной массы, времени удерживания и характера фрагментации (MS2). Например, AM-2201 и AM-2201 N- (4-фторпентил) имеют одинаковые точную массу и время удерживания, а также очень похожие структуры фрагментации, как показано на рисунке 3.

 
Рисунок 2 – Типичные хроматограммы, полученные с помощью ЖХ-МС-МС в положительном режиме электрораспыления для смеси, содержащей все 24 аналита. Верхняя кривая первой панели представляет собой полную ионную хроматограмму (TIC), за которой следуют выделенные ионные хроматограммы всех соединений, распределенных по трем панелям для удобства представления (показаны родительские ионы).

Однако сигнал при m/z 340, генерируемый потерей фтора из вторичного углерода, присутствует только в MS2 AM-2201 N-(4-фторпентила), что позволяет различать два схожих каннабиноида. Аналогично, JWH-019 и JWH-122 элюируются в пределах 0,05 мин друг от друга и имеют одинаковую точную массу. Их можно было идентифицировать по совершенно различным характерам фрагментации MS2 без повторного ввода в колонку (рисунок 4). Также были получены данные MS3, но они фактически не нужны для данного метода проверки. Данные MS3 могут применяться для идентификации новых образцов с одинаковой массой родительских ионов, временем удерживания и MS2.

На рисунке 2 показаны все соединения, элюированные между 2,36 и 4,94 мин. Фальсифицированные натуральные средства могут содержать новые неизвестные синтетические наркотические вещества. Поэтому необходимо проявлять осторожность при работе с быстрым хроматографическим разделением; если присутствуют дополнительные, еще не охарактеризованные синтетические каннабиноиды, чрезмерная коэлюция может скомпрометировать их идентификацию после сбора данных с использованием полного нецелевого сканирования в методе сбора.


Рисунок 3 – Схема фрагментации двух изомеров: (а) АМ-2201 и (б) АМ-2201 А-(4-фторпентил) изомер.

Рисунок 4 – Схема фрагментации двух изомеров: (a) JWH-019 и (b) JWH-122.

Матричные эффекты оценивались в четырех образцах (таблетках и образцах на основе трав) с добавлением 24 аналитов перед экстракцией. Сравнение хроматограмм с хроматограммами стандартной смеси не выявило различий в областях пиков для 24 аналитов. Для оценки переноса использовали подвижную фазу, введенную после образцов. При концентрациях анализируемого вещества ниже 50 нг/мл перенос не выявлялся, тогда как большинство соединений приводило к переносу 0,1-0,3% при концентрации 250 нг/мл и 0,4 - 1,0% при 1000 нг/мл. Поэтому мы предлагаем использовать две пустые инъекции между образцами с высокими концентрациями. Линейность 15 отобранных репрезентативных (для 24 соединений) соединений, , введенных в травяную матрицу, оценивалась в диапазоне концентраций 0,01 – 1000 нг/мл (n = 21). Линейная регрессия применялась путем построения областей пиковых откликов для каждого соединения как функции их соответствующей концентрации и применения весового коэффициента 1/x. Коэффициенты корреляции калибровочной кривой (r2) варьировались в диапазоне от 0,996 до 0,999. Пределы обнаружения (рассчитанные при трехкратном отношении сигнал/шум) находились между 0,03 нг/мл и 0,61 нг/мл для всех соединений, кроме одного, независимо от наличия матрицы; Предел обнаружения (LOD) для (±) 3-эпи-CP 47,497-C8-гомолога составлял 1,52 нг/мл. Было важно разработать простой и экономичный метод экстракции, который также был бы быстрым и эффективным, обладал хорошей степенью извлечения в дополнение к быстрому ЖХ-МС-МС разделению. Для 12 репрезентативных (для 24) каннабиноидов степень извлечения по трем концентрациям (50, 250 и 1000 нг/мл) составляла от 92 до 110%. 

Прецизионность и точность метода оценивали для 10 репрезентативных соединений при концентрации 50, 250 и 1000 нг/мл. Каждый уровень концентрации был приготовлен пять раз путем добавления соответствующего количества стандартного аналита в матрицу (таблетку или травяную основу), каждый образец был введен пять раз. Точность внутрипроцессного анализа находилась в пределах относительного стандартного отклонения (СКО) от 1,2 – 4,0% на всех трех уровнях концентрации. Процедуру повторили через неделю, чтобы определить точность между измерениями, которая варьировалась в пределах СКО от 2,9% до 9,7%. Несмотря на то, что для валидации метода были использованы только 10 соединений, во время разработки метода все 24 соединения многократно вводились по отдельности и вместе без существенных изменений (то есть в пределах ошибки повторяемости) в площадях пиков и времени удерживания. Например, после 25 инъекций стандартного АМ-694 (пять повторов для каждого из пяти различных образцов), изменение времени удерживания практически не наблюдалось (СКО 0,09%), наблюдалось только небольшое изменение площади пика (СКО 1,7 %). Аналогичные результаты были получены для других соединений (данные не приведены). Точность метода, определяемая путем сопоставления рассчитанной концентрации с истинным значением, добавленным в матрицу, составляла 10% для всех 10 соединений при всех испытанных концентрациях.


Применение методики при анализе изъятых образцов

В качестве метода проверки мы использовали быструю ЖХ-МС-МС для анализа 11 изъятых образцов (четыре ароматические палочки, две сигареты, три растительных образца, один образец каннабиса и одна таблетка), все образцы были получены из незарегистрированных источников. Семь из них дали положительный результат на содержание каннабиноидов. В одной из ароматических палочек были обнаружены два синтетических каннабиноида: JWH-018 при 4,48 мин и JWH-073 при 4,24 мин, результаты приведены на рисунке 5.

 

Рисунок 5 – Незаконный продукт (ароматическая палочка), показывающий наличие контролируемых синтетических каннабиноидов: JWH-018 и JWH-073. На верхнем графике приведена общая ионная хроматограмма (TIC), две нижние хроматограммы, отражают обнаружение JWH-018 (средняя панель) и JWH-073 (нижняя панель).

Эти два синтетических аналога являются контролируемыми веществами и, как подчеркивается во введении, их присутствие в продуктах является незаконным. Поэтому ароматические палочки подлежали изъятию из продажи.
При хроматографическом разделении образца растения конопли (рисунок 6) был обнаружен ряд эндогенных каннабиноидов. Основное психоактивное соединение THC, элюировали через 4,93 мин.

Каннабигерол был обнаружен через 4,36 мин и, в отличие от ТГК, он не вызывает симптомы психоза, даже при взаимодействии с рецептором СВ2 в головном мозге (1). Каннабидиол, идентифицированный на 4.48 мин, является другим естественным каннабиноидом, который очень распространен в каннабисе, концентрация в растительном экстракте до 40%; Однако, он не является психоактивным.

Каннабинол, который также взаимодействует с рецептором CB2, обычно присутствует в низких концентрациях в образцах свежего каннабиса, но его концентрация возрастает при окислительной деградации ТГК под воздействием света или воздуха (13). Он был идентифицирован на 4,69 мин с сигналом приблизительно в пять раз выше по сравнению с ТГК (рисунок 6), что указывает на то, что образец каннабиса был подвергнут обширному окислению.

Рисунок 6 – Образец каннабиса показывает наличие THC (ТГК), каннабидиола, каннабигерола и каннабинола: (a) общая ионная хроматограмма (TIC), (b-d) экстрагированные ионные хроматограммы, показывающие обнаружение четырех соединений каннабиноида.

Предварительно образец конопли был проанализирован в государственной лаборатории с применением методов валидированной тонкослойной хроматографии (ТСХ) и ГХ-МС. Другие исследуемые образцы были ранее проанализированы двумя проверенными методами высокопроизводительной жидкостной хроматографии (HPLC) со спектрометрией с фотодиодной матрицей (PDA) и обычной ГХ-МС в той же правительственной лаборатории.

Результаты, полученные при применении метода быстрой ЖХ-МС-МС, оказались согласованными со стандартными методами в части отсутствия ложноположительных или ложноотрицательных результатов; Однако новый подход был в четыре раза быстрее проверенного метода HPLC-PDA, в шесть раз быстрее метода ГХ-МС, и обладал большей чувствительностью, по сравнению с обоими указанными методами. Поскольку исходные соединения быстро метаболизируются, в большинстве методов анализа каннабиноидов проводят анализ метаболитов биологических образцов (таких как моча, кровь и волосы), (11,15). Для проверки подозрительных фальсифицированных смесей следует указать идентификационный номер исходного препарата. Для проверки предполагаемых фальсифицированных смесей требуется идентификация исходного препарата. Недавно было сообщено о нескольких методах быстрой ЖХ-МС-МС для скрининга каннабиноидов, при которых 15-20 родительских соединений, а в некоторых случаях более 20 метаболитов были разделены в периоды времени от 8 до 20 мин (12, 14, 16). Подавляющее большинство из них –  это подходы, основанные на MRM, как следствие, они являются целевыми и позволяют контролировать только аналоги, предопределенные в методе; Они совершенно неэффективны для обнаружения аналогов каннабиноидов нового поколения.


Заключение

В статье описан процесс разработки и проверки быстрого, селективного и чувствительного метода скрининга ЖХ-МС-МС для одновременной идентификации 24 синтетических и натуральных каннабиноидов, присутствующих в травяных курительных смесях, ароматических палочках и таблетках. Высокая разрешающая способность масс-спектрометра с орбитальной ионной ловушкой и его совместимость с высокой пиковой эффективностью, обеспечиваемой хроматографией частиц со структурой ядро-оболочка, способствовала превосходной селективности метода. Дополнительную достоверность в идентификации аналита для 24 целевых соединений обеспечивали с помощью схем фрагментации.

Новизна этой работы заключается в сборе данных с полным сканированием и высокой разрешающей способностью, что позволяет проводить постаналитическую идентификацию дополнительных соединений в комплексных матрицах при нецелевом подходе. В настоящее время такой подход является очень актуальным ввиду того, что постоянно появляются новые поколения каннабиноидов, которые на шаг опережают контролируемые вещества. Недавние отчеты Scheidweiler и его команды (15), а также Shanks и его коллег (8) указывают на признание аналитическим сообществом и растущую потребность в развитии и применении подходов нецелевого скрининга. Наш метод скрининга с применением быстрой ЖХ-МС-МС может стать незаменимым инструментом судебно-медицинской экспертизы для выявления нелегальных наркотиков и фальсифицированных продуктов.

Предыдущие статьи
Контакты
  • Телефон:
    +375 (29) 640-41-26
    +375 (17) 237-42-11 доб. 418,
  • Контактное лицо:
    Дежурный специалист
  • Адрес:
    ул. Кропоткина, 91 а, Минск, 220020, Беларусь
Карта
social-icon
Loading...